Из лимфоцитов в нейроны

Перепрограммирование клеток и редактирование генома   

Достижения в инструментах перепрограммирования клеток и редактирования генома предоставили новые способы исследования функции генов человека в различных клеточных контекстах человека, например, таких как нейроны. В частности, генная инженерия эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток оказалась мощной для анализа специфических последствий мутаций, связанных с заболеванием, в контролируемых генетических фонах.

Однако нельзя ожидать, что эти методы предоставят полностью адекватные клеточные модели заболеваний, для которых в основе риска лежат высокополигенные механизмы. Например, данные крупномасштабного исследования ассоциации по всему геному предполагают, что 30–50% генетического риска для каждого из психоневрологических расстройств, которые были изучены на сегодняшний день, можно объяснить совместным воздействием тысяч общих генетических вариантов с небольшими эффектами индивидуумами, так что отдельные пациенты, вероятно, будут нести уникальную комбинацию многих способствующих вариантов .

Во время нормального развития единственными клетками, способными изменять идентичность клонов, являются незафиксированные стволовые клетки и клетки-предшественники. В большинстве исследований по репрограммированию в качестве донорских клеток используются гетерогенные фибробласты, что ставит вопрос о том, ограничивается ли способность к трансдифференцировке недифференцированными клетками-предшественниками

Ограничения плюрипотентных клеток 

Одним из способов изучения такого сложного генетического фона в нейронах человека является перепрограммирование клеток пациента в iPS-клетки . Тем не менее, плюрипотентная клетка имеет значительную вариабельность линии к линии с точкой зрения способности дифференцировки, предположительно из - за различия в их эпигенетическом и плюрипотентном состоянии. Более того, iPS-клетки часто кариотипически нестабильны при выращивании в условиях отсутствия питанмя, их рост и формирование являются трудоемкими и трудно масштабируемыми для большого количества особей. 

Нейроны их фибробластов

Другой способ получения нейронов - получение индуцированных нейрональных (iN) клеток из фибробластов за одну стадию преобразования, что в принципе значительно облегчило бы их получение от многих пациентов. Однако, в отличие от неонатальных фибробластов человека, фибробласты взрослого человека оказалось трудно перепрограммировать в синаптически компетентные iN-клетки. Более того, фибробласты неоднородны и плохо определены и должны быть увеличены in vitro из инвазивных и болезненных биопсий кожи для получения достаточного количества, что увеличивает риск приобретения случайных генетических мутаций в течение длительного периода культивирования.

Предыдущие исследования показали преобразование клеток крови и мочи в различные нейронные клетки-предшественники, которые неэффективно давали начало функциональным нейронам . Описанные преобразования были достигнуты с помощью временной экспрессии факторов репрограммирования iPS-клеток, недавно было показано, что этот подход индуцирует плюрипотентное промежуточное состояние. 

Преобразование Т - клеток в нейроны 

В литературе описано одноэтапное преобразование Т-клеток периферической крови взрослого человека непосредственно в функциональные нейроны с использованием эписомальных векторов без необходимости предшествующей экспансии in vitro. Этот подход более удобен, чем подходы, основанные на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, для применения в больших когортах людей и позволит разработать функциональные тесты для изучения сложных заболеваний головного мозга человека. Таким образом , окончательно дифференцированные клетки человека могут быть эффективно трансдифференцированы в отдаленно родственную линию.

Полученные из Т-клеток нейроны (iN-клетки) путем доставки неинтегрируемых генов, демонстрировали стереотипную морфологию нейронов и экспрессировали множественные пан-нейрональные маркеры, запускали потенциалы действия и были способны формировать функциональные синапсы. Эти клетки были стабильными в отсутствие экзогенных факторов репрограммирования. Добавление малых молекул и оптимизированные системы культивирования дали эффективность преобразования до 6,2%, что привело к генерации> 50 000 iN клеток из 1 мл периферической крови за один этап без необходимости начального увеличения. 

Ограничения пожилого возраста 

В отличие от репрограммирования iPS-клеток, репрограммирование на iN-клетки было значительно ниже у пожилых доноров. 

Эписомальные вектора 

Таким образом , функциональные синапс-образующие человеческие iN-клетки могут быть индуцированы из свежевыделенных и хранящихся периферических Т-клеток взрослых с использованием неинтегрирующихся эписомальных векторов. Можно выделить мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), используя градиентное центрифугирование, и электропорировать эти клетки с помощью эписомальных векторов, кодирующих четыре фактора транскрипции Brn2, Ascl1, Myt1l и Ngn2, вместе называемых пулом BAMN, который, как ранее было обнаружено, генерирует iN-клетки из фибробластов и усилить зеленым флуоресцентным белком (EGFP) в миллионах PBMC. Трансфицированные клетки затем культивируют в IL-2 и CD3 / CD28 антител , содержащих носители , поддерживающие рост Т - клеток. 

Примечательно, что после посева человеческих клеток крови на глиальные клетки мышей последние  быстро разрушаются. Можно предположить, что нетрансфицированные активированные человеческие Т-клетки предположительно начали атаковать глию мыши. Отмена IL-2 и активаторов Т-клеток после 3-го дня не только смягчила эту проблему, но и улучшила репрограммирование в 2,7–3,6 раза. Переключение на нейрональную среду на 3-й день также спасает жизнеспособность глии, но улучшает репрограммирование лишь незначительно. 

Комбинированное ингибирование, как способ выживание нейронов 

Блокада BMP и TGF-бета путей способствует индукции нервной ткани во время нормального развития, во время дифференцировки ES клеток, а также из фибробластов. Более того, сообщалось, что цАМФ способствует выживанию и созреванию нейронов. Количество iN-клеток можно значительно увеличить  активатором аденилатциклазы форсколином (в 1,9 раза), блокатором пути BMP дорсоморфином (в 3,7 раза) и ингибитором пути TGF-β SB431542 (в 4,6 раза). Комбинация трех ингибиторов (форсколин, дорсоморфин и SB431542; 3sm) показала аддитивный эффект на количество iN-клеток по сравнению с засеянными клетками (в 8,7 раза). Эти комбинированные улучшения привели к эффективности перепрограммирования до 6,2%, что соответствует 54 265 iN клеток из 1 мл крови.  

Ингибирование ROCK

В попытке еще больше повысить эффективность репрограммирования исследователи  проверили шесть дополнительных соединений - IWP2, DAPT, ретиноевую кислоту, SU5402, Y26732 и SP600125 - пути нацеливания, ранее участвовавшие в дифференцировке нейронов в комбинации с форсколином, дорсоморфином и SB431542. Из отдельных протестированных соединений исследователи обнаружили, что ингибирование ROCK увеличивало как относительное количество клеток iN, так и морфологическую сложность перепрограммирования клеток по сравнению с контролем DMSO. Более того, добавление нейротрофических факторов не привело к существенному увеличению образования iN-клеток, но при длительном лечении препаратами было получено больше iN-клеток, чем при временном лечении низкомолекулярными соединениями.

Однако важно отметить, что когда исследователи  тестировали их функциональные свойства, клетки, созданные в присутствии ингибирования ROCK, не были способны генерировать зрелые потенциалы действия, в отличие от клеток, выращенных без ингибитора ROCK. Отсутствие зрелых потенциалов действия предполагает, что ингибирование ROCK просто влияет на перестройки цитоскелета, но нарушает функциональное созревание нейронов. 

Только глутаматергические нейроны 

iN-клетки крови экспрессируют везикулярный транспортер глутамата (VGLUT), но не везикулярный транспортер GABA, GAD65 или тирозингидроксилазу, что позволяет предположить, что iN-клетки крови являются возбуждающими нейронами, подобными iN-клеткам фибробластов и Ngn2-ES iN-клеткам. На основании результатов RNA-seq исследователи обнаружили экспрессию маркеров переднего мозга и кортикальных слоев II – V, но не слоев I, IV и VI. Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал, что на самом деле почти все iN-клетки крови были положительными для SATB2 и CTIP2, но отрицательными для REELIN, как предполагают результаты по РНК

От фибробластов к лимфоцитам 

Таким образом, описанная здесь конверсия iN-клеток крови позволяет генерировать человеческие нейроны практически от любого человека, в отличие от использования фибробластов в качестве донорских клеток, которые, как оказалось, трудно получить от определенных популяций. такие как дети и психически больные люди. Кроме того, большая доступность позволяет масштабировать отдельных доноров, что будет способствовать оценке того, как распространенные генетические варианты с низким уровнем риска вносят вклад в клеточную функцию при сложных генетических заболеваниях.

Еще одно преимущество перед фибробластами как донорскими клетками состоит в том, что фибробласты необходимо размножать in vitro для получения достаточного количества, что может привести к накоплению вредных мутаций. Взрослые периферические Т-клетки человека могут быть преобразованы в iN-клетки со всеми ключевыми биохимическими и функциональными свойствами нейронов, можно отметить , что - подобно iN-клеткам фибробластов человека - эти клетки демонстрируют менее зрелые синаптические свойства по сравнению с с первичными iN-клетками мыши или iPS-клетками

Нейроглия , как модулятор

С механистической точки зрения было неожиданным обнаружить, что - в отличие от трансдифференцировки iN-клеток из фибробластов - раннее совместное культивирование глии было критическим для трансдифференцировки клеток крови. Эффект глии здесь, по-видимому, принципиально отличается от репрограммирования фибробластов, где сокультура глии существенно не влияет на эффективность конверсии, а не на созревание синапсов . Напротив, роль глиальных факторов влияет на генерацию iN-клеток в целом при трансдифференцировании из клеток крови.

Поскольку трансфицированные PBMC также прикрепляются к слою фибробластов, но не перепрограммируются, можно предположить, что монослой глиальных клеток обеспечивает секретируемые или зависимые от клеточного контакта факторы для клеток крови, которые необходимы для трансдифференцировки в дополнение к их прикреплению.